Uma nova proteína híbrida composta de superóxido

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 6892 (2023) Citar este artigo

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Uma nova proteína híbrida composta por um complexo de Cu (II) ativo em superóxido dismutase (CuST) e lisozima (CuST@lysozyme) foi preparada. Os resultados das análises espectroscópicas e eletroquímicas confirmaram que CuST se liga à lisozima. Determinamos a estrutura cristalina da lisozima com resolução de 0,92 Å, o que revelou que o grupo imidazol His15 da lisozima se liga ao centro Cu (II) de CuST na posição equatorial. Além disso, CuST foi fixado em posição pela fraca coordenação axial do grupo hidroxila Thr89 e pela ligação de hidrogênio entre o grupo guanidínio do resíduo Arg14 e o grupo hidroxila de CuST. Além disso, a combinação de CuST com lisozima não diminuiu a atividade da superóxido dismutase de CuST. Com base nos estudos espectrais, eletroquímicos, estruturais e cálculos químicos quânticos, é proposto um mecanismo de desproporção de O2 catalisado por CuST@lysozyme.

Os organismos aeróbicos produzem a energia necessária para sustentar suas vidas por meio da respiração aeróbica. Espécies reativas de oxigênio (ROS), como radicais hidroxila (·OH), oxigênio singleto (1O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e superóxido (O2–) são os subprodutos inevitáveis desse processo. Essas ERO causam sérios danos oxidativos a biomoléculas, como lipídios, carboidratos, hormônios, proteínas e ácidos nucléicos. Entre essas ERO, o O2– é produzido por sistemas de transporte de elétrons, processos fagocíticos, oxidação enzimática e proteínas transportadoras de oxigênio, como hemoglobina e mioglobina1. Sob condições protônicas, o O2– reage com prótons (H+) para produzir outras ERO, como ·OH e H2O22. Portanto, a remoção de O2– é uma prioridade para organismos aeróbios. Para remover o O2– e evitar o dano oxidativo induzido pelo O2–, os organismos aeróbicos possuem metaloenzimas conhecidas como superóxido dismutases (SODs). SODs catalisam a desproporção de O2– em H2O2 e O2, conforme mostrado na reação (1):

Como as SODs desempenham um papel crucial na proteção das biomoléculas contra danos oxidativos, a expectativa de vida dos organismos depende da atividade eficiente da SOD. Organismos com maiores atividades de SOD apresentam menores taxas de mortalidade e vice-versa3. Os íons metálicos encontram-se nos centros ativos dos SODs, que catalisam a desproporção de O2– para produzir H2O2 e O2 por meio das reações (2) e (3), respectivamente:

Com base nos íons metálicos presentes nos centros ativos, os SODs são classificados em quatro categorias; SODs contendo Ni, Fe, Mn, Cu e Zn são conhecidos como NiSOD4,5,6,7,8, FeSOD9,10,11,12,13, MnSOD14,15,16,17,18,19 e CuZnSOD20, 21,22, respectivamente. Neste estudo, focamos no CuZnSOD mais prevalente, que contém íons Cu(II) e Zn(II) em seu centro ativo. Enquanto o íon Zn(II) fixa a estrutura de coordenação secundária em torno do centro ativo23, o íon Cu(II) catalisa a reação de desproporcionalidade do O2–, conforme mostrado nas reações (4) e (5) abaixo:

Para utilizar o CuZnSOD nativo como agente de remoção de O2, questões como seu alto custo e instabilidade devem ser resolvidas . Neste contexto, complexos de Cu(II) com baixos pesos moleculares têm sido relatados como modelos funcionais de SOD25,26. Dentre esses complexos de Cu (II), aqueles coordenados pelo ácido salicílico como ligante foram relatados como modelos funcionais de SOD . Nosso grupo também relatou complexos de Cu (II) compostos por porções de fenolato e L-aminoácidos . No entanto, esses compostos de coordenação podem ser tóxicos para biomoléculas após a liberação de íons Cu(II) de seus ligantes28. Para resolver este problema, focamos na forte capacidade de ligação de íons Cu (II) das proteínas .

Neste estudo, como primeira abordagem, investigamos a formação de uma proteína híbrida composta por lisozima, que escolhemos devido à sua estabilidade e cristalinidade, e um complexo funcional de Cu (II) mimético de SOD. Esperava-se que esta proteína híbrida mimética de SOD melhorasse a biocompatibilidade e estabilidade do complexo funcional de Cu (II) do modelo SOD.

14), forming an imidazolate anion. When the pH of the solution is between 6 and 14, the imidazole group is neither protonated nor deprotonated. Therefore, in pH 7.0 solution, imidazole can bind to the Cu(II) center in the neutral state. Although this UV–vis spectral behavior was not sufficiently quantitative to determine the binding constants, the spectral change was qualitatively saturated. In addition, CuST-Imi was obtained through the reaction of CuST with 1 eq. of imidazole in good yield (77.8%). Based on these results, we presume that CuST binds sufficient well with the imidazole group of His15./p>

> 2000 μM). Both CuST-Imi and CuST showed higher SOD activities than CuCl2, indicating that the SOD activity of the CuST unit was retained, even when CuST was bound to lysozyme. These results indicated that lysozyme acquired SOD activity by forming a composite with CuST. Unfortunately, the SOD activity of the CuST unit did not improve upon binding to lysozyme. This is because the hydroxyl group of CuST forms hydrogen bonds with the guanidinium group of Arg14, neutralizing the positive charge. As a result, O2– ions cannot form strong electrostatic interactions with the guanidinium group of Arg14, although hydrogen bonds play an important role in fixing the CuST unit to lysozyme./p>

was compared to the expected S(S + 1) for the spin state (doublet state). In all the calculations performed, the spin contamination was found to be less than 3% and therefore negligible. The structures of the complexes were visualized using ChemCraft software Ver. 1.660. To model the optical properties, the 120 lowest excitation states were chosen. An increasing number of excitations resulted in bands in the deep-ultraviolet region of the spectrum, which was not the target region of this research. Calculations were performed for the isolated molecules and molecules in the solvent medium (water). A polarizable continuum model was adopted for the latter61. The molar absorptivity, ε (L mol−1 cm−1), was calculated using the GaussSum 3.0 program package62. The g-tensor and hyperfine coupling constants (A-tensor) were calculated using the ORCA 5 program package63. A hybrid Becke three-parameter functional (B3LYP) was used in combination with the Pople basis set (6-311G(d,p)). The A-tensor was obtained as the sum of three contributions: the isotropic Fermi contact (AFC), anisotropic dipolar (\({\mathrm{A}}_{x, y, z}^{D}\)), and spin–orbit coupling term \({(\mathrm{A}}_{x,y,z}^{SO})\). This approximation reproduces the target parameters64,65./p>